一、前言：

1、             現(xiàn)狀

目前獸醫(yī)用藥幾乎占據(jù)了所有抗微生物yw的50%，因此食品病原菌、條件致病菌和共生菌不可避免的成了耐藥菌。在過去的50年中大約有100萬噸的kss被釋放到生物圈中。歐洲動物衛(wèi)生聯(lián)盟（European Federation of Animal Health ，FEDESA）對歐盟和瑞士kss使用統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，僅1997年用于人類健康的kss達5460噸，用于動物健康的kss達3465噸，用于動物生長促進劑的kss達1575噸，并有逐年增加的趨勢。

在我國，由于獸醫(yī)用藥制度的不完善及一些養(yǎng)殖廠受經(jīng)濟利益的驅(qū)使及相應(yīng)的檢測監(jiān)督體系不健全，yw的濫用現(xiàn)象更為嚴重，動物產(chǎn)品中獸藥的污染時有發(fā)生。其潛在的致癌、致畸作用引起了社會的普遍關(guān)注，由于水產(chǎn)品中氯霉素含量過高，歐盟委員會于今年1月作出禁止中國動物源食品進口的協(xié)議，使得我國水產(chǎn)品對歐盟出口嚴重受挫，雖然現(xiàn)在部分產(chǎn)品開始解禁，但形式依然不容樂觀；美國、日本等國也開始高度關(guān)注我國水產(chǎn)品的質(zhì)量，并出臺一系列相關(guān)政策，對我國出口動物性產(chǎn)品進行限制。在現(xiàn)代文明的世界，健康{dy}的貿(mào)易法則將是關(guān)稅、價格、質(zhì)量所不可比擬的，政治上的友好往來無法替代經(jīng)濟貿(mào)易中的游戲規(guī)則。

2、食品中獸藥殘留對人類的危害

2.1耐藥菌株的產(chǎn)生

kss使用和xj耐藥性永遠是互相依存、互相制約的矛盾的兩個方面，xj耐藥非正常增加，往往是kss的非正常使用的結(jié)果。早在1920-30年青霉素問世時，Dr Fleming就提出了青霉素的耐藥性問題。隨著時代的發(fā)展和各種新藥的出現(xiàn)，耐藥性菌株也接踵而至（即包括yw選擇壓力的結(jié)果也包括xj自身的進化）。kss的副作用以及耐藥菌株的存在將嚴重威脅著人類的健康，而且臨床亞zl水平的kss更容易促使抗性基因的轉(zhuǎn)移，比如對動物進行低水平四環(huán)素zl，其糞腸菌群由對四環(huán)素敏感逐漸變成抗四環(huán)素{zh1}發(fā)展成對其它yw也產(chǎn)生抗性。在長期的生活中，恰恰是人類和動物腸道的正常菌群成了耐藥基因的儲存庫，并不斷的將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病菌，并在人和動物中交叉?zhèn)鞑?，尤其是釋放到環(huán)境中耐藥菌的危害更為嚴重，可造成耐藥基因的迅速轉(zhuǎn)移。

2.2kss的毒副作用

殘留在動物性食品中的kss被人們食用后，除了加速人體內(nèi)耐藥菌株的進化之外，kss本身的毒副作用往往威脅人類尤其是孕婦和嬰兒的健康，這一點在過去往往很容易被忽視。

2.2.1氯霉素

主要由Streptomyces venezuelae產(chǎn)生，目前已能人工合成。它能抑制xj蛋白質(zhì)生物合成，其效應(yīng)部位位于核糖體上，因而對大多數(shù)G+菌和G－菌都有殺傷力。氯霉素的毒副作用較多，其常見的是再生障礙貧血、造血功能紊亂、灰嬰綜合征、肢體感覺和運動障礙及休克。雖然氯霉素在動物疾病防治上曾發(fā)揮過一定的作用，但由于氯霉素可以產(chǎn)生致命性的副作用，因此歐盟已經(jīng)在畜牧、水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中禁止使用。

2.2.2b－內(nèi)酰胺

b－內(nèi)酰胺類kss通過抑制xj轉(zhuǎn)肽酶的活性而干擾細胞壁肽聚糖的合成，安芐青霉素和青霉素G是該類最常見的兩種化合物，由Penicillium chrysogenum產(chǎn)生。它可以通過胎盤傳給胎兒，也能通過乳腺進入乳中。最常見的副作用是以皮膚出現(xiàn)紅斑為主要癥狀的過敏反應(yīng)以及胃腸道紊亂引起的腹瀉、惡心和嘔吐。

2.2.3四環(huán)素

包括Oxytetracycline （土霉素，OTC）、tetracycline （四環(huán)素，TC）、 chlortetracycline （金霉素，CTC） 和doxycycline （強力霉素，DC）等。

2.2.4  b－興奮劑

        為擬交感神經(jīng)類yw，該類興奮劑的受體為b2受體故得名。該類興奮劑可以促使肌肉骨骼肌血管壁擴張、支氣管和子宮平滑肌松弛。因而在獸醫(yī)臨床上b2興奮劑被廣泛用作支氣管擴張藥和子宮松弛藥，同時也被非法用作動物營養(yǎng)再分配的促生長劑。副作用，如：焦躁、震顫、過敏、神智不清、食欲不振、惡心和嘔吐等以及心悸、高血壓、心律失常、心動過速等心血管癥狀，其中擬交感神經(jīng)類物質(zhì)在組織中的溢出均可導致組織壞死。

2.2.5雌js

是一種人工合成的非固醇類雌js，主要用于zl婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤，為一種致癌物質(zhì)；在肝臟中代謝緩慢，最終能隨尿和糞便排出。副作用包括：水腫、引起性欲沖動、改變月經(jīng)周期、乳房異常發(fā)育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、tt、皮膚紅斑、風疹。對于雄性動物來說，大劑量的雌js可以增加血管栓塞的危險。此外，雌js還能引起子宮內(nèi)膜增生，使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌js還可以導致骨骼發(fā)育閉合，停止生長。也能促使生殖道變形，對于雄性動物能使精子變形以及嘔吐等。

2.2.6氨基甙類kss

主要包括慶大霉素、鏈霉素、新霉素、卡那霉素等，為以氨基環(huán)醇和氨基糖相連成核糖單位的多價陽離子復合物。氨基甙類通過與xj核糖體不可逆結(jié)合而干擾xj蛋白質(zhì)的合成，進而導致細胞膜塌陷。氨基甙類yw的主要副作用是對聽覺器官和腎的毒性、過敏反應(yīng)以及對神經(jīng)肌肉的影響。其中，慶大霉素能引起肝功紊亂、外周和zssj炎（包括腦炎、呆滯、抽搐）；鏈霉素能導致神經(jīng)紊亂，包括視覺神經(jīng)炎和外周神經(jīng)炎，以及嚴重的皮炎、過敏等超敏感反應(yīng)。

二、獸藥殘留的快速檢測方法

目前國際上對kss和js類yw殘留的檢測主要有儀器分析法（包括HPLC和GC-MS）和生物學快速檢測法（如：ELISA、RIA、CharmⅡ等）。其中，儀器分析法既要求儀器設(shè)備具有相當高的精度，也要求技術(shù)人員具有一定的操作和分析技能。作為儀器分析法，其昂貴的價格和軟件更新的緩慢以及操作上的煩瑣限制了此法的推廣；但由于檢測的靈敏度可以達到ng水平，在一些國家大型實驗室里仍作為檢驗的參考依據(jù)使用。而生物學快速檢測法由于其操作上的簡便、快速以及達到ng水平的靈敏度等優(yōu)點，以成為動物產(chǎn)品中獸藥殘留檢測的一種重要手段。尤其是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）和CharmⅡ，其操作上的簡便、快速和強烈的信噪比、達到ng水平的靈敏度等優(yōu)點，其缺陷在于該法會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，但做為一種快速篩選方法備受技術(shù)人員的青睞，在檢測部門有著廣泛的應(yīng)用前景。

  不同的ELISA原理直接影響其檢測下限、特異性及結(jié)果的計算。

樣品的前處理

不同樣品有其特定的前處理方法，主要有以下幾種：

有機物抽提法：（氯霉素）

利用yw在有機物中的溶解性，達到分離純化的目的

樣品均質(zhì)         稱量      乙晴和或乙酸乙酯抽提       離心      吹干

      異辛烷/氯仿或正己烷抽提     離心      取水相分析

離子交換法（如：C18過柱法）（鏈霉素）

離子交換是利用一些帶離子基團的物質(zhì)，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按所帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。

樣品稱量      溶解     上柱

C18柱平衡                 洗柱      吸柱干燥     洗提      吹干

緩沖液重懸      分析

（免疫）親和層析（雌js）

   利用生物大分子的生物學特性而設(shè)計的層析分離技術(shù)，如利用抗原和抗體、酶和酶的抑制物或配體、js和受體等之間的親和力，在一定條件下，兩者可緊密結(jié)合形成復合物，若將其中一者固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方，并達到很高的純度?，F(xiàn)有商品化生產(chǎn)，（方便，減少裝柱等繁瑣步驟）其操作步驟與上者相似，可以按照試劑盒提供的步驟進行。

 檢測原理

   微生物受體免疫分析法，屬于免疫分析法的一種，其建立的基礎(chǔ)是yw功能團與微生物受體位點的結(jié)合反應(yīng)。在某些方面類似于放射免疫分析（RIA），所不同的是RIA使用抗體作為結(jié)合劑，而受體分析則是使用xj細胞的固定位點當做特殊的結(jié)合劑。

    一個單一的xj細胞含有可結(jié)合yw的特殊結(jié)合位點，yw和受體位點的結(jié)合反應(yīng)離解常數(shù)低，因而具特異性和靈敏性。對于該法具體原理Charm公司未有詳細深入的報道（商業(yè)方面考慮），主要是利用兩種不同的xj提供7大類kss結(jié)合的必須位點，yw的功能團與位點有關(guān)，不象免疫分析只涉及到側(cè)鏈，一種微生物受體可結(jié)合一類yw的所有yw。

象ELISA類似，這種結(jié)合也是一種競爭結(jié)合。在試管中加入一定量的xj（受體）、放射性標記yw和樣品，樣品中的yw和放射性標記yw競爭結(jié)合受體，未于受體位點結(jié)合的標記性yw在讀數(shù)前被去掉，加入閃爍液，在分析儀上讀數(shù)。

檢測的一般程序

準備工作：首先按說明書配制好所需的提取緩沖液、M2緩沖液、陰性對照和陽性對照。

儀器零點測定：用空試管測定儀器的零點是否正常。

試劑和儀器有效性確認：檢測陰性對照液和陽性對照液各3次，求出cpm值的平均值，與出廠的計數(shù)單對比，{zh0}能在其±10%左右波動。如果與計數(shù)單相比偏移較大，試劑可能部分失效，但只要陽性平均值/陰性平均值小于0.7，試劑仍然可用，但靈敏度會有所降低。

控制點的確定：控制點是陰性結(jié)果與陽性結(jié)果的臨界值。利用控制點來判斷結(jié)果。有兩種確定控制點的方法：根據(jù)樣品的種類或檢測水平選擇適當?shù)目刂泣c確定方法?？刂泣c確定方法有二。有些說明書上兩種方法都列出，用戶可根據(jù)需要選擇，{zh0}選第二種。

方法一：直接以陰性對照來確定控制點，一般樣品干擾小或接近儀器的下限時，采用這種方法，只需再做3次，與前3次試劑性能確認的結(jié)果一起求平均值，然后減法X%，即為控制點。X為變數(shù)，由廠家用定量方法校準。

方法二：以空白加標樣品來確定控制點。這種方法的關(guān)鍵是找到陰性樣品，如果沒有其它的定量方法找陰性樣品，可根據(jù)陰性對照平均值來找陰性樣品（陰性對照平均值±X%）。用此陰性樣品，按檢測水平和稀釋倍數(shù)，加kss標準品，用此空白加標樣品，測定6次CPM值，求平均值，控制點＝平均值＊（1＋20%）。

測定實際樣品

前處理：不同的樣品具不同的前處理方法，一般尿樣、血清、血漿等只需用緩沖液稀釋即可，而組織樣品則需均質(zhì)、提取、孵育等過程，對于蜂蜜等一些樣品則要過柱?？偟膩碚f，前處理要比ELISA更簡便、快速。

按照操作說明檢測結(jié)合試劑片加入試管；加入300微升水混均；加入處理過的樣品；加入標記性yw，混合；孵育；離心，棄去上清液；加水混均；加閃爍液，混均；讀數(shù)。

三、實驗室分析質(zhì)量控制

涉及儀器的校正、過程控制、標準物控制、環(huán)境、實驗室管理（監(jiān)控所進行的測試及記錄結(jié)果，以便發(fā)現(xiàn)發(fā)展趨勢，統(tǒng)計技術(shù)進行結(jié)果評審）

1、快速篩選方法及定性方法

選擇性：檢出目的物質(zhì)的能力；

靈敏性：樣品中檢出這種yw真正陽性結(jié)果的比率；

準確性：所得值和真實值的一致性，用不確定度來衡量——重復多次測定值和真實值之差；

檢測限：分析方法能從樣品背景信號中檢測出待檢物質(zhì)的{zd1}濃度；

重復性：

2、定量方法的附加要求

回收率：

定量限：分析方法能對樣品中待檢物質(zhì)進行定量檢測的{zd1}濃度，反映該方法在低濃度端分析結(jié)果的可靠性；

精密度：對同一樣品重復測定，每次測定值和均值的接近程度，主要反映隨機誤差；

重復性：批內(nèi)重復、批間重復線形范圍：曲線的擬和

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